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    本發明提供自瘤胃真菌Orpinomyces sp. Y102所建構之cDNA基因庫中經篩選所獲得一種纖維素水解酵素基因，此基因全長為1071個鹼基對，包含一個開放閱讀架構(ORF)，可轉譯出含有357個胺基酸纖維分解酵素；同時亦提供包含該基因之載體及轉形細胞。此外，進一步將此基因轉型至大腸桿菌後，可使大腸桿菌產生分解CMC、beta-glucan與xylan的活性，為一多功能的纖維分解酵素，且同時具有分解纖維二糖的能力，可直接將纖維質分解成葡萄糖。
    公开号:TW201317348A
    申请号:TW100138660
    申请日:2011-10-25
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Yo-Chia Chen；Jeng-Chen Liu；Hau-Yu Wang；Teng-Chieh Hsu；Gia-Luen Guo；Wen-Song Hwang；Jia-Baau Wang
    申请人:Inst Nuclear Energy Res Atomic Energy Council；Univ Nat Pingtung Sci & Tech；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    一種纖維素水解酵素及其基因
    本發明係關於一種自瘤胃中真菌所選殖的一段纖維水解酵素基因及其蛋白質，以提供畜牧業或能源業生產纖維分解酵素或基因之來源。
    木質纖維主要由纖維素、半纖維素等物質組成，是自然界最豐富的天然資源，其中，纖維素是一種不溶於水、呈現纖維狀，且十分堅韌的物質，約有10,000至15,000個葡萄糖藉由β-1,4醣苷鍵(β-1,4 glucosidic bonds)所連結構成的長鏈狀物質，而鏈與鏈彼此之間以氫鍵進行鏈結，纖維素形成緊密網狀結構。包括人類在內的多數生物並無法直接利用這些含纖維素的物質作為碳源，這些不但成為廢棄物的主要來源之一，甚至有些還會造成不利的影響，例如，穀物中的木質纖維會包覆澱粉形成團粒，影響家禽、家畜對於飼料的利用，更造成環境污染。
    纖維素分解酵素是一群水解酵素的總稱，經由彼此協同作用下，能將不具溶解性的纖維素水解成單糖，而使纖維素可易於被生物利用。依據酵素的特性與作用機制，主要區分成三大類，第一類是外切性纖維分解酵素，又稱為纖維素外雙糖水解酵素基因，第二類是內切性纖維分解酵素，第三類是纖維雙糖分解酵素。將含有纖維分解酵素的添加物加入飼料中，即可有效解決纖維素所形成營養障礙。
    近年來隨著能源快速被消耗與地球暖化問題逐漸嚴重，生質能源被認為是替代能源的一種，以生質酒精為例，它可加入汽油中，減少汽油的消耗量。由葡萄糖聚合而成的纖維素是全世界最豐富的有機物，若能妥善加已分解利用，皆可提供豐富的生質能源來源，更可避免產生與人類競爭糧食的危機。纖維素轉化成酒精通常需要三個步驟，分別是前處理、糖化及發酵三個程序，其中，糖化過程是將纖維素分解成微生物可發酵糖類的過程。酸水解與酵素水解是較常應用於糖化作用的方式，其中酸水解會產生抑制後續微生物醱酵的物質(例如：furfural與p-hydroxybenzoic acid)，且對操作人員與環境具有較大的為害，因此酵素水解成為較好的選擇。
    酵素糖化需要大量的纖維分解酵素，因此，纖維分解酵素成為纖維酒精生產時重要的成本支出，因此如何找尋高效率的纖維分解酵素是纖維酒精產業發展的重要關鍵之一。瘤胃真菌是近年來逐漸受到重視的纖維利用族群，雖然是瘤胃中數量最少的微生物，以綿羊為例約佔瘤胃中微生物總量8%，但卻具有高效率的纖維分解能力，尤其是當宿主吃入纖維化較高的草料時，真菌的角色就更為重要；瘤胃真菌除具有演化優勢外，許多的研究也證實瘤胃真菌所呈現的纖維素分解酵素對於纖維素的分解能力高於一般常被使用之木黴屬真菌數倍至數千倍不等。根據目前的研究顯示，絕對厭氣性真菌對於結晶型纖維素的分解能力的確高於已受到廣泛研究並被用於工業生產上的Trichoderma reesei QM9414屬真菌，瘤胃真菌在瘤胃中所扮演的角色到目前為止並無法直接被證實，然而該科真菌在活體外卻呈現多種的植物細胞壁結構性多醣分解酵素的活性，包括exoglucanase、exoglucanase、beta-glucosidase、xylanase、xylosidase、pectinase等等顯示瘤胃真菌具有全方位分解植物細胞壁結構性多醣的酵素系統。除對單一受質有高活性外，目前從瘤胃真菌中所得到的纖維分解酵素許多為多功能之酵素(multiple functions enzyme)，除可分解不同形式之纖維素外，也可對木聚糖、葡聚糖(β-glucan)等進行分解，對於複合多種不同成分的植物殘體更具有更高的分解效率。
    為了提高對纖維素之利用，本發明係提供一種纖維素水解酵素，其係由胺基酸序列SEQ ID NO:2所構成之蛋白質。
    本發明同時提供一種纖維素水解酵素，其係由界定於SEQ ID NO:2之胺基酸序列進行一個或多個胺基酸之取代、刪除或添加後，所衍生具有纖維素水解酵素活性之蛋白質。
    而上述之纖維素水解酵素係具有分解carboxylmethyl cellulose、xylan及beta-glucan等纖維受質之能力；同時亦具有水解具β-1,4糖苷鍵的葡萄糖鏈之活性。
    本發明亦提供一種纖維素水解酵素基因，其係由核苷酸序列SEQ ID NO:1所構成；並提供一種載體，其係包含上述核苷酸，其中該載體寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 940643；並進一步提供一種轉形細胞，其係包含上述核酸，其中該轉形細胞係為大腸桿菌。
    下列實驗設計係為說明，不應限制本發明之範疇，合理的變化，諸如對於熟習此項技藝者顯而易見為合理者，可於不脫離本發明之範疇下進行。
    為使充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後： 實施例1
    本發明以黃牛的瘤胃液作為分離源，以Rolling-tube的技術進行菌株(Orpinomyces sp. Y102)的分離並將菌株培養於含有濾紙(Whatman No.1)為碳源的培養基中。培養後將菌株取出並依據其動孢子(zoospore)與菌體(thallus)的形態特徵進行鑑定。將菌株培養於含有avicel的培養基中進行誘導，誘導後以Trizol試劑進行全RNA萃取，並依據SMARTTM cDNA Library Construction Kit User Manual(BD Biosciences)所建議的方式分別進行mRNA分離、第一股cDNA合成、第二股cDNA合成、黏接入載體等步驟完成cDNA基因庫的建構。之後，將cDNA基因庫填裝(packaging)入λ噬菌體並將噬菌體培養於含有beta-glucan(90501,Megazyme)、xylan(X-0627 Sigma-Aldrich)及carboxylmethyl cellulose(C-4888 Sigma-Aldrich)等受質的培養基中，並以剛果紅(Congo red,0379,Amresco)染色的方式進行篩選，將具有透明環的溶菌圈取出，並以E. coli BM25.8進行in vivo excision，將噬菌體載體轉成質體進行保存。並將篩選出的基因以自動定序儀進行定序。
    而將選殖出之纖維素外雙糖水解酵素基因命名為cbh16基因，並將帶有cbhC16基因質體(pTriplEX2)的E. coli DH5α轉型株分別接種至LB/β-glucan洋菜膠培養皿、LB/xylan洋菜膠培養皿及LB/CMC洋菜膠培養皿，培養隔夜後剛果紅染色、NaCl退染，觀察有無透明環，結果如第1圖(a)、(b)及(c)所顯示，結果顯示，含有cbhC16基因的大腸桿菌具有分解β-glucan、xylan及CMC等木質纖維組成分的能力，顯示此酵素所轉譯出的蛋白質為一多功能性的纖維分解酵素。而將該cbhC16基因定序之結果顯示，其係由SEQ ID NO:1所顯示之核苷酸序列所構成，該cbhC16基因全長為1071個鹼基對，包含一個開放閱讀架構(open reading frame)，可轉譯出含有357個胺基酸纖維分解酵素；而轉譯之酵素分子為SEQ ID NO:2所顯示之胺基酸序列。上述ebhC16基因序列與基因庫中最相近基因(U97154)相似度僅63%，所轉譯出的胺基酸與已知最相近的胺基酸序列(AF031934)相同度亦僅為65%。 實施例2
    本發明中之纖維素外雙糖水解酵素(cbhC16)基因表達係使用pET21系統(Novagen)進行。將含有cbhC16基因的質體的大腸桿菌(E. coli DH5α)接種於含有ampicillin(100μg/mL)的LB培養液(Luria-Bertani broth)，在37℃下培養16小時後，以小量質體純化套組(mini-MTM plasmid DNA Extraction System，Viogene,Taiwan)進行質體純化並作為後續聚合酶連鎖反應的模板來源。為了將cbhC16選殖至pET21a，我們分別在C16基因的forward端加入了EcoR I的限制酶切位及reverse端加入Xho I限制酶切位，兩個引子分別命名為Eco-C16-F及Xho-C16-R。將引子對、模板、緩衝溶液、dNTP、聚合酶等應試劑混合後，置入熱循環儀中以95℃預熱1分鐘後，再進行30次下列條件的循環反應95℃ 30秒、56℃ 30秒及72℃ 2分鐘，最後再以72℃反應5分鐘，完畢後取5 μL PCR產物以1%洋菜膠電泳觀察結果。將PCR產物回收後以限制酶EcoR I與Xho I進行水解後回收含cbhC16基因的DNA片段，再與經過相同限制酶截切的pET21a(Novagen,USA)以T4 ligase(M1804,Promega)進行黏接反應(ligation)。將黏接完成的產物轉形入勝任細胞(E. coli DH5α)，並以定序方式確認插入片段，建構完成的表達載體命名為pET21-C16。
    將前述pET21-C16表達載體轉形至E.coli BL21(DE3)，沾取轉形成功菌落接種於5 ml LB-Amp培養液中(LB培養液中含100 μg/mL ampicillin)，以37℃，225 rpm震盪培養16小時。將培養好的菌液以1：100的比例，每5 mL菌液接種於500 mL新鮮LB-Amp培養液中，以25℃，180 rpm震盪培養，當菌液之OD600達0.6~0.8時加入IPTG於培養基中，使最終濃度為1 mM。誘導4小時後，以4000 x g離心20分鐘沉降菌體。將收集的菌體懸浮於檸檬酸緩衝液(50mM，pH6)以超音波進行破菌後以離心(10000g,30min)方式分離粗酵素液。將前述粗酵素液分別以CM陽離子樹酯(10021091,GE Healthcare)與Ni-NTA親合性樹酯(124118449,QIAGEN)所填充的管柱進行純化，將純化後酵素進行透析以去除多餘鹽類與置換緩衝溶液。將pET21-C16轉型至E. coli BL21(DE3)，誘導前後與純化結果如第2圖所顯示，其中Lane 1為誘導前之產物、Lane2為誘導後之產物，Lane 3為純化後之產物，於該第2圖之結果顯示經誘導後的大腸桿菌，可產生1個約38KDa的誘導產物，此一誘導產物經過離子交換樹酯與親合性樹酯所填充的管柱層析後可被純化出。 實施例3
    將純化後酵素40μl與360μl的1% CMC(Sigma)或avicel(Merck)均勻混合於檸檬酸緩衝溶液(50 mM,pH 6.0)並於50℃下作用10分鐘。反應後以dinitrosalicylic acid method(DNS)測定還原糖量並換算活性。一個unit(U)定義為酵素量為每分鐘還原糖釋出1μmole。蛋白質濃度以BCA蛋白質定量套組(Pierce Ltd. USA)進行定量。純化後的產物對carboxylmethyl cellulose具有16 U/mg protein的比活性，顯示此段基因所表達而成酵素蛋白具有內切型纖維水解酵素(即水解具β-1,4糖苷鍵的葡萄糖鏈)功能之活性。 實施例4
    將本發明中之纖維素水解酵素(cbhC16)直接與纖維雙糖進行反應，結果如第3圖所顯示，纖維雙糖(於第3圖圖中之黑點)隨著時間不斷地減少，而反應液中的葡萄糖(於第3圖圖中之白點)隨著時間不斷地增加，於72小時可至少降解50%的纖維雙糖，此結果證明本發明中之cbhC16酵素具有可截切纖維雙糖的能力，具有纖維雙糖酵素功能之活性。
    經由上述之實施例之數據可知，本發明係提供一種纖維分解酵素基因，其篩選自瘤胃真菌Orpinomyces sp. Y102，且其係由SEQ ID NO:1所顯示之核苷酸序列所構成，核苷酸序列全長為1071個鹼基對，此核苷酸序列經由轉譯可形成SEQ ID NO:2所顯示之胺基酸序列，轉譯可得到357個胺基酸，計算所得到分子量為38.2 KDa。
    本發明的特色為此基因序列經由序列比對後，最相近基因(U97154)相似度僅63%，所轉譯出的胺基酸與已知最相近的胺基酸序列(AF031934)相同度亦僅為65%，因此其基因序列確實具有新穎性。
    另外，本發明同時將此基因轉形直接導入大腸桿菌後，使得此大腸桿菌具有分解Carboxylmethyl cellulose、β-glucan和xylan三種受質之能力；且再將此基因嵌入一重組蛋白表現載體中，並轉形至大腸桿菌中，進行酵素蛋白大量誘導生產，誘導所得之酵素蛋白經由管柱純化後，其對於產物Carboxylmethyl cellulose具有16U/mg protein之比活性；另外，進行纖維雙糖水解測試，於纖維雙糖隨著時間增加不斷減少，於72小時可得約50%雙糖水解效率。
    由上述可知，本發明所提供之纖維素水解酵素基因所轉譯得之酵素蛋白為一多功能纖維分解酵素。
    <110>
    <120>　纖維水解酵素基因
    <210>1
    <211>1071
    <212>DNA
    <213>　Orpinomyces sp. Y102
    <220>
    <221>CDS
    <400>1

    <110>
    <120>　纖維水解酵素
    <210>2
    <211>357
    <212>胺基酸
    <213>　Orpinomyces sp. Y102
    <220>
    <221>PRT
    <400>2


    第1圖係為cbh16基因轉型至大腸桿菌後展現的受質分解能力，大腸桿菌培養於含(a)beta-glucan、(b)xylan、(c)carboxylmethyl cellulose等受質的培養基上，並經剛果紅染色所呈現的結果。
    第2圖係為含有cbhC16基因的大腸桿菌經誘導前、後及cbhC16酵素純化後之蛋白質電泳結果圖。
    第3圖係為本發明中纖維素水解酵素(cbhC16)水解纖維二糖之結果圖。
    权利要求:
    Claims (7)
    [1] 一種纖維素水解酵素，其係由胺基酸序列SEQ ID NO:2所構成之蛋白質。
    [2] 一種纖維素水解酵素，其係由界定於SEQ ID NO:2之胺基酸序列進行一個或多個胺基酸之取代、刪除或添加後，所衍生具有纖維素水解酵素活性之蛋白質。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項所述之纖維素水解酵素，其中該纖維素水解酵素具有分解carboxylmethyl cellulose、xylan及beta-glucan等纖維受質之能力。
    [4] 如申請專利範圍第1或2項所述之纖維素水解酵素，其中該纖維素水解酵素具有水解具β-1,4糖苷鍵的葡萄糖鏈之活性。
    [5] 一種纖維素水解酵素基因，其係由核苷酸序列SEQ ID NO:1所構成。
    [6] 一種載體，其係包含申請專利範圍第5項之核酸，其中該載體寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 940643。
    [7] 一種轉形細胞，其係包含申請專利範圍第5項之核酸，其中該轉形細胞係為大腸桿菌。
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